Indhold
DNA
Deoxyribonukleinsyre og proteiner. DNA er organiseret i enheder kaldet gener, som hver koder for en bestemt RNA eller proteinsekvens. Gener studeres for at lære om biologisk struktur og funktion, evolution, sygdom og mange andre aspekter af levende systemer. For at studere gener i detaljer skal DNA isoleres og oprenses fra celler af interesse.
DNA-ekstraktion
Selvom DNA fra en enkelt celle kan ekstraheres og undersøges, er det ikke nok med det blotte øje. For at få en tilstrækkelig mængde til spooling, jo flere celler skal du arbejde med, jo bedre (mange millioner).
Eksakte protokoller varierer betydeligt for at tage højde for de unikke egenskaber ved specifikke prøver, men de generelle trin er homogenisering, lysering, fordøjelse, separering og opsamling. Proceduren udføres bedst i et lille (afhængigt af størrelsen på prøven) glas eller plastrør.
En prøve blandes eller males generelt for grundigt at adskille cellerne fra hinanden. Dette gør cellebestanddelene mere tilgængelige for de følgende reagenser. Detergent eller enzymer sættes derefter til homogenatet for at lysere cellemembranerne (og nukleare membraner, hvis cellerne er eukaryote) for at frigøre DNA'et. På dette tidspunkt er DNA'et omgivet af proteiner, lipider, kulhydrater --- alt det andet, der var indeholdt i cellerne.
En yderligere enzymatisk fordøjelse kan være nødvendig for at nedbryde proteiner, så de ikke binder sig til DNA og forstyrrer dens opsamling. DNA separeres fra resten af celleindholdet ved tilsætning af kold, ren, ethyl- eller isopropylalkohol. DNA er ikke opløseligt i disse alkoholer, så det kondenserer for at forsøge at minimere dets kontakt med alkoholen. De kondenserede DNA opsamles derefter, sædvanligvis ved centrifugering --- eller spooling.
DNA-spole
DNA-opsamling ved spolning er effektiv, når en stor mængde DNA opnås fra en ekstraktionsprocedure. Det er også en fremragende demonstrationsmetode, da en imponerende floke af rent DNA er tydeligt synlig.
For at spole DNA skal separeringstrinnet udføres omhyggeligt. Hvis det ikke var en del af den tidligere tilsatte lysisreagensblanding, skal en koncentreret saltopløsning (natriumchlorid) sættes til opløsningen før alkoholtilsætningstrinnet. Den kolde alkohol hældes langsomt ned langs reagensglasets side for at danne et lag oven på den vandige opløsning, idet man undgår blanding. Hvis det gøres korrekt, danner alkoholen sit eget lag oven på det salte lag. Så kommer spolen.
For at opsamle DNA'et fra det salte lag, skal du forsigtigt placere en glasstang om end alkohollaget, indtil det berører bunden af røret. Drej langsomt stangen mellem fingrene, mens du ser grænsefladen mellem de to lag. Hvis der er tilstrækkeligt DNA, klumper det sig sammen ved grænsefladen mellem lagene til dannelse af en mælkeagtig gennemsigtig masse. Drej stangen for at pakke DNA'et rundt om det (det er den spolende del) og træk den ud af røret. DNA'et kan overføres til et andet rør med ren alkohol til opbevaring eller yderligere analyse.