Indhold
Højtydende væskekromatografi (HPLC) er en laboratorieteknik, der bruges til at adskille og identificere forbindelser. Det er en type søjlekromatografi, der er afhængig af forskellige polariteter af forbindelser i en opløsning for at adskille dem. HPLC adskiller sig fra standard søjlekromatografi, fordi den bruger tryk til at tvinge opløsningen gennem søjlen hurtigere og derfor giver hurtigere og til tider mere nøjagtige resultater. Målet er at adskille forbindelser i søjlen og få dem til at gå ud separat.
co-elutering
På grund af hastigheden af HPLC og det afhænger af forskellige polariteter af forbindelser, kan to forbindelser med lignende struktur og polariteter forlade chromatografiapparatet på samme tid eller næsten samme tid. Dette er kendt som coelution. Coelution gør det nøjagtigt at bestemme, hvilken del af blandingen der elueres på hvilket tidspunkt vanskeligt.
Adsorberede forbindelser
HPLC bruger typisk en glaskolonne fyldt med perler lavet af forskellige materialer. Blandingerne, der tvinges gennem søjlen, har kemikalier, der binder med forskellige styrker til perlerne. Bindestyrken, der afhænger af ligheden i polaritet, bestemmer, hvor længe kemikaliet vil binde til perlen, inden den frigives. Nogle forbindelser binder så stærkt, at de i det væsentlige aldrig frigøres fra perlerne i søjlen og måles aldrig i opløsningen, der forlader søjlen.
Koste
Typiske laboratorieseparationsteknikker involverer udvikling af et assay eller en fremgangsmåde til separering og derefter implementering af dette assay for at adskille individuelle forbindelser fra en opløsning. Imidlertid resulterer dette normalt i flere opløsninger, der også skal gennemgå procedurer, hvilket fører til en eksponentiel stigning i kompleksiteten. Selvom HPLC ofte kan forenkle og fremskynde denne proces, kan omkostningerne ved udvikling af et HPLC-apparat blive enorme. Selvom det er meget mere effektivt at udvikle et HPLC-apparat, er det meget dyrere end at udvikle andre assays til separering af forbindelser. Dette gør det ikke økonomisk bæredygtigt for mange små privatejede laboratorier.
kompleksitet
HPLC bruges ikke kun til at adskille enkle forbindelser, det bruges også til at isolere specifikke proteiner ud af en cellulær blanding. I dette tilfælde er perlerne i søjlen normalt belagt med et antistof, der er specifikt for det protein, du skal opsamle. Proteinerne binder antistofferne, og den resterende opløsning ledes gennem søjlen, derefter frigives proteinerne ved hjælp af en anden opløsning og opsamles. Dette kræver en meget kvalificeret tekniker til at overvåge søjlen til enhver tid og sikre sig, at processen kører nøjagtigt som planlagt.