Indhold
- Seriefortyndinger
- Klargøring af plader til beregning af titer
- Tælling og beregning af virustiter
- Advarsler
Beregning af titer for en virus er en kompliceret måde at sige, at en videnskabsmand tæller antallet af vira i en bestemt prøve. For at beregne virustitere inficerer forskere plader med voksende bakterier med virale opløsninger i forskellige koncentrationer og beregner antallet af vira i den originale opløsning ved at tælle de bakterier, der er døde på grund af den virale infektion.
Seriefortyndinger
Sæt handsker på, fyld 10 kulturrør med 9 ml bouillon og mærk dem "10 ^ -1", "10 ^ -2", "10 ^ -3" og så videre indtil "10 ^ -10." Disse rør vil blive brugt til virale serielle fortyndinger, der bruges til at beregne fagtiter. Da vira kan vokse til utroligt høje koncentrationer, skal du fortynde dem for at tælle dem effektivt. Hvert rør repræsenterer en ti gange fortynding af virussen.
Tag 1 ml af den viruskultur, du vil beregne fagtiter til, og overfør den til røret med titlen “10 ^ -1” med en pipette. Bland røret godt. Dette er din første fortoldning på ti gange.
Tag 1 ml af den blandede kultur fra dit rør mærket "10 ^ -1" og overfør det med en ny pipette til det næste rør, mærket "10 ^ -2." Bland dette rør også.
Fortsæt dette mønster for at oprette en seriefortyndingsserie. Du ender med 9 rør på 9 ml og 1 rør på 10 ml. De virale belastninger i dine rør fortyndes overalt fra 10 gange (dit første rør) eller 100 gange (dit andet rør) til ti milliarder gange (dit endelige rør).
Klargøring af plader til beregning af titer
Tag 10 rør med tryptonblød agar og 10 Petri-plader, og mærk dem, så de svarer til dine seriefortyndingsrør.
Løsn hættene, så de ikke springer ud i varmen, og anbring derefter agarrørene i et bæger med kogende vand. Dette smelter agaren, så du kan hælde den i Petri-plader.
Overfør dine rør til et varmt vandbad indstillet til mindst 45 grader celsius. Dette vil sikre, at din agar ikke størkner i rørene, før du har en chance for at hælde den i en petriskål.
Tilføj to dråber bakteriekultur til din agar og bland den forsigtigt. Dette er de bakterier, der dræbes, så du kan tælle antallet af viruspartikler i en bestemt opløsning.
Tilsæt 1 ml af hver seriefortynding til dets tilsvarende agarør, mens rørene stadig er i varmt vandbad. For eksempel skal 1 ml af din 10 ^ -1 seriefortynding gå i agarrøret mærket "10 ^ -1."
Bland hvert rør, og hæld derefter hvert rør i Petri-pladen med den tilsvarende etiket. Dette skaber et tyndt lag agar, der er inokuleret med bakterier og vira i hver plade. Lad pladerne vokse natten over i en inkubator.
Tælling og beregning af virustiter
Tag dine tallerkener ud af inkubatoren og undersøg dem. Du skal se overskyede områder i hele pladen, hvor bakterier er vokset, bortset fra små klare pletter, der kaldes plaques. Disse plaques er pletter med døde bakterier, og hver plak repræsenterer en virus.
Find en plade, der har mellem 30 og 300 plaques, og tæl det nøjagtige antal plaques på denne plade.
Tag antallet af plaketter ind på din plade og gang med 10. Hvis du tæller 157 plaketter, ville du få 1570.
Multiplicer det antal, du fik i det forrige trin, med det inverse af tallet på dit fortyndingsrør. Hvis den plade, du valgte, for eksempel var 10 ^ -5-pladen, ville du multiplicere 1570 med 10 ^ 5 for at få 157000000. Dette endelige antal er din fagtiter og repræsenterer antallet af vira pr. Ml af din oprindelige kultur.