Indhold
- Restriktionsenzymer og begrænsningssider
- Den rigtige orientering
- Ligering af klæbrige ender Kræver mindre DNA
- Forskellige enzymer kan give den samme klæbrige ende
Molekylær kloning er en almindelig bioteknologisk metode, som enhver studerende og forsker skal være bekendt med. Molekylær kloning ved anvendelse af en type enzym kaldet et restriktionsenzym til at skære humant DNA i fragmenter, der derefter kan indsættes i plasmid-DNA'et fra en bakteriecelle. Restriktionsenzymer skærer dobbeltstrenget DNA i halvdelen. Afhængigt af restriktionsenzymet kan udskæringen resultere i enten en klæbrig ende eller en stump ende. Klæbrige ender er mere nyttige ved molekylær kloning, fordi de sikrer, at det humane DNA-fragment indsættes i plasmidet i den rigtige retning. Ligeringsprocessen eller sammensmeltning af DNA-fragmenter kræver mindre DNA, når DNA'et har klæbrige ender. Endelig kan flere klæbrige ende-restriktionsenzymer producere den samme klæbrige ende, selvom hvert enzym genkender en anden restriktionssekvens. Dette øger sandsynligheden for, at din DNA-region af interesse kan udskæres med klæbrige enzymer.
Restriktionsenzymer og begrænsningssider
Restriktionsenzymer er enzymer, der skærer genkender specifikke sekvenser på dobbeltstrenget DNA og skærer DNA'et i halvdelen ved den sekvens. Den genkendte sekvens kaldes restriktionsstedet. Restriktionsenzymer kaldes endonukleaser, fordi de skærer dobbeltstrenget DNA, hvilket er, hvordan DNA normalt findes, på steder, der er i mellem enderne af DNA'et. Der er mere end 90 forskellige restriktionsenzymer. Hver genkender et særskilt restriktionssite. Restriktionsenzymer spalter deres respektive restriktionssteder 5.000 gange mere effektivt end andre steder, som de ikke genkender.
Den rigtige orientering
Restriktionsenzymer findes i to generelle klasser. De skærer enten DNA i klæbrige ender eller stumpe ender. En klistret ende har en kort region af nukleotider, byggestenene til DNA, der er uparret. Denne uparrede region kaldes et overhæng. Det siges, at overhænget er klistret, fordi det vil og vil parre sig med en anden klæbrig ende, der har komplementær overhængssekvens. Klæbrige ender er som længe mistede tvillinger, der søger at omfavne hinanden stramt, når de mødes. På den anden side er stumpe ender ikke klæbrige, fordi alle nucleotider allerede er parret mellem de to DNA-strenge. Fordelen ved klæbrige ender er, at et fragment af humant DNA kun kan passe ind i et bakterieplasmid i en retning. I modsætning hertil, hvis både det humane DNA og det bakterielle plasmid har stumpe ender, kan det humane DNA indsættes head-to-tail eller tail-to-head i plasmidet.
Ligering af klæbrige ender Kræver mindre DNA
Selvom DNA med stavender har en lettere tid med at finde hinanden på grund af deres "klæbrighed", kan hverken klæbrige ender eller stumpe ender smelte sammen til et kontinuerligt stykke DNA. Dannelse af et kontinuerligt stykke DNA, der er fuldstændigt bundet, kræver et enzym kaldet en ligase. Ligaser forbinder nøgleotidernes rygrad ved de klæbrige eller stumpe ender, hvilket resulterer i en kontinuerlig kæde af nukleotider. Fordi klæbrige ender finder hinanden hurtigere på grund af deres tiltrækning for hinanden, kræver ligeringsprocessen mindre humant DNA og mindre plasmid-DNA. De stumpe ender af DNA og plasmider er mindre tilbøjelige til at finde hinanden, og derfor kræver ligering af stumpe ender, at mere DNA sættes i reagensglasset.
Forskellige enzymer kan give den samme klæbrige ende
Restriktionssteder er placeret i organismernes genom, men er ikke jævnt fordelt. I plasmider kan de konstrueres til at være placeret lige ved siden af hinanden. Forskere, der ønsker at skære et fragment af humant DNA fra det menneskelige genom, skal finde restriktionssteder, der er foran og bag i fragmentet. Ud over at sikre, at et DNA-fragment indsættes i den rigtige retning, kan forskellige klæbrige enzymer skabe den samme klæbrige ende, selvom de genkender forskellige restriktionssekvenser. For eksempel har BamHI, BglII og Sau3A forskellige genkendelsessekvenser, men producerer den samme GATC-klistrede ende. Dette øger sandsynligheden for, at der vil være klæbrige endebegrænsningssteder, der flankerer dit humane gen af interesse.