Indhold
- Genomik og DNA-sekventering
- Definition af DNA-sekventering
- DNA-sekventering: Tidlig forskning
- Sangers største ambition var sekventering af store genomer i stor skala, men sekventering af en minuscule bakteriofag 's basepar blekede i sammenligning med sekventering af de 3 milliarder basepar i det humane genom. Ikke desto mindre var det at lære at sekvensere hele genomet til en ringe bakteriofag et stort skridt hen imod at sammenstyre hele genomet af mennesker. Fordi DNA og kromosomer består af millioner af basepar, adskiller de fleste sekventeringsmetoder DNA i små tråde, og derefter deles DNA-segmenterne sammen; det tager bare tid eller hurtige, sofistikerede maskiner.
- Grundlæggende om DNA-sekventering
- Metoder til DNA-sekventering: Sanger-metoder
- En anden spændende udvikling var haglegeværmetoden, der tilfældigt samplede og sekventerede op til 700 basepar på én gang. Sanger er også kendt for sin anvendelse af dideoxy-metoden (dideoxynukleotid), der indsætter et kædeterminerende nukleotid under DNA-syntese for at markere sektioner af DNA til analyse.Dideoxynukleotider forstyrrer DNA-polymeraseaktivitet og forhindrer nukleotider i at bygge videre på en DNA-streng.
- DNA-sekventeringstrin
- Fremskridt inden for DNA-sekventeringsteknologi
- Det menneskelige genom-projekt
- Andre DNA-sekventeringseksempler
- Etiske implikationer af DNA-sekventering
Nukleotider er de kemiske byggesten i livet og findes i DNA fra levende organismer. Hvert nukleotid består af et sukker, phosphat og a nitrogenholdig base: adenin (A), thymin (T), cytosin (C) og guanin (G). Den specifikke rækkefølge af disse nukleotidbaser bestemmer, hvilke proteiner, enzymer og molekyler der vil blive syntetiseret af cellen.
Bestemmelse af rækkefølge eller sekvensen af nukleotider er vigtig for undersøgelsen af mutationer, evolution, sygdomsprogression, genetisk test, retsmedicinsk undersøgelse og medicin.
Genomik og DNA-sekventering
Genomics er studiet af DNA, gener, geninteraktioner og miljøpåvirkninger på gener. Hemmeligheden bag at afsløre den komplekse indre virkning af gener er at kunne identificere deres struktur og placering på kromosomer.
Det blå af levende organismer bestemmes af rækkefølgen (eller sekvensen) af nukleinsyre-basepar i DNA. Når DNA replikeres parres adenin med thymin og cytosin med guanin; uoverensstemmende par betragtes mutationer.
Siden den dobbelte helix deoxyribonucleic acid (DNA) molekyle blev konceptualiseret i 1953, er der foretaget dramatiske forbedringer inden for genomik og storskala DNA-sekventering. Forskere arbejder flittigt med at anvende denne nye viden til individualiseret behandling af sygdomme.
Samtidig tillader løbende diskussioner forskere at holde sig foran de etiske implikationer af sådanne hurtigt eksploderende teknologier.
Definition af DNA-sekventering
DNA-sekventering er processen til at opdage sekvensen af forskellige nukleotidbaser i DNA-fragmenter. Hele gensekventering tillader sammenligning af kromosomer og genomer til stede i samme og forskellige arter.
Kortlægning af kromosomer er nyttigt til videnskabelig forskning. Analyse af mekanismer og struktur for gener, alleler og kromosomale mutationer i DNA-molekyler antyder nye måder at behandle genetiske lidelser og stoppe for eksempel kræftformet tumorvækst.
DNA-sekventering: Tidlig forskning
Frederick Sangers DNA-sekventeringsmetoder fremførte kraftigt området genomik begyndende i 1970'erne. Sanger følte sig klar til at tackle DNA-sekventering efter vellykket sekventering af RNA, når man studerede insulin. Sanger var ikke den første videnskabsmand, der faldt i DNA-sekventering. Hans smarte DNA-sekventeringsmetoder - udviklet i takt med kollegerne Berg og Gilbert - vandt imidlertid en nobelpris i 1980.
Sangers største ambition var sekventering af store genomer i stor skala, men sekventering af en minuscule bakteriofag 's basepar blekede i sammenligning med sekventering af de 3 milliarder basepar i det humane genom. Ikke desto mindre var det at lære at sekvensere hele genomet til en ringe bakteriofag et stort skridt hen imod at sammenstyre hele genomet af mennesker. Fordi DNA og kromosomer består af millioner af basepar, adskiller de fleste sekventeringsmetoder DNA i små tråde, og derefter deles DNA-segmenterne sammen; det tager bare tid eller hurtige, sofistikerede maskiner.
Grundlæggende om DNA-sekventering
Sanger kendte den potentielle værdi af sit arbejde og samarbejdede ofte med andre forskere, der delte hans interesser i DNA, molekylærbiologi og livsvidenskab.
Selvom langsomt og dyrt i sammenligning med dagens sekventeringsteknologier, blev Sanger's DNA-sekventeringsmetoder rost på det tidspunkt. Efter forsøg og fejl fandt Sanger den hemmelige biokemiske "opskrift" til at adskille DNA-strenge, skabe mere DNA og identificere rækkefølgen af nukleotider i et genom.
Materialer af høj kvalitet kan let købes til brug i laboratorieundersøgelser:
Metoder til DNA-sekventering: Sanger-metoder
Sanger regnede ud, hvordan man skærer DNA i små segmenter ved hjælp af enzymet DNA-polymerase.
Derefter lavede han mere DNA fra en skabelon og indsatte radioaktive sporstoffer i det nye DNA for at afgrænse sektioner af de adskilte strenge. Han erkendte også, at enzymet havde brug for en primer, der kunne binde til et specifikt sted på skabelonstrengen. I 1981 gjorde Sanger igen historie ved at finde ud af genomet i mitokondrialt DNA's 16.000 basepar.
En anden spændende udvikling var haglegeværmetoden, der tilfældigt samplede og sekventerede op til 700 basepar på én gang. Sanger er også kendt for sin anvendelse af dideoxy-metoden (dideoxynukleotid), der indsætter et kædeterminerende nukleotid under DNA-syntese for at markere sektioner af DNA til analyse.Dideoxynukleotider forstyrrer DNA-polymeraseaktivitet og forhindrer nukleotider i at bygge videre på en DNA-streng.
DNA-sekventeringstrin
Temperaturen skal justeres omhyggeligt under sekventeringsprocessen. Først sættes kemikalier til et rør og opvarmes for at afdække (denaturere) det dobbeltstrengede DNA-molekyle. Derefter afkøles temperaturen, hvilket lader primeren binde.
Derefter hæves temperaturen for at tilskynde til optimal DNA-polymerase (enzym) aktivitet.
Polymerase bruger typisk de tilgængelige normale nukleotider, der tilsættes i en højere koncentration.Når polymerase kommer til et "kædeterminerende" farvestofbundet nukleotid, stopper polymerasen, og kæden ender der, hvilket forklarer, hvorfor de farvede nukleotider kaldes "kædeterminerende" eller "terminatorer."
Processen fortsætter mange, mange gange. Til sidst er det farvestofbundne nukleotid blevet anbragt i hver enkelt position af DNA-sekvensen. Gelelektroforese og computerprogrammer kan derefter identificere farvestoffarverne på hver af DNA-strengene og finde ud af hele sekvensen af DNA baseret på farvestoffet, farvestoffets placering og længden af strengene.
Fremskridt inden for DNA-sekventeringsteknologi
Sekvensering med høj kapacitet - generelt benævnt næste generations sekventering - bruger nye fremskridt og teknologier til sekvens af nukleotidbaser hurtigere og billigt end nogensinde før. En DNA-sekventeringsmaskine kan let håndtere store DNA-strækninger. Faktisk kan hele genomerne udføres i løbet af timer i stedet for år med Sangers sekventeringsteknikker.
Næste generations sekventeringsmetoder kan håndtere DNA-analyse med højt volumen uden det tilføjede trin til amplifikation eller kloning for at få nok DNA til sekventering. DNA-sekventeringsmaskiner kører flere sekventeringsreaktioner på én gang, hvilket er billigere og hurtigere.
I det væsentlige kører den nye DNA-sekventeringsteknologi hundredevis af Sanger-reaktioner på en lille, let læselig mikrochip, der derefter køres gennem et computerprogram, der samler sekvensen.
Teknikken læser kortere DNA-fragmenter, men det er stadig hurtigere og mere effektivt end Sangers sekventeringsmetoder, så selv store projekter kan hurtigt afsluttes.
Det menneskelige genom-projekt
Det Human Genome Project, afsluttet i 2003, er en af de mest berømte sekventeringsundersøgelser, der er gjort til dato. Ifølge en artikel i 2018 i Videnskabsnyheder, består det menneskelige genom af ca. 46.831 gener, som var en formidabel udfordring til sekvensen. Topforskere fra hele verden brugte næsten 10 år på at samarbejde og konsultere. Anført af National Human Genome Research
Institutet, projektet har kortlagt det menneskelige genom ved hjælp af en sammensat prøve taget fra anonyme bloddonorer.
Human Genome Project var afhængig af bakteriel kunstig kromosom (BAC-baseret) sekventeringsmetode for at kortlægge basepar. Teknikken anvendte bakterier til at klone DNA-fragmenter, hvilket resulterede i store mængder DNA til sekventering. Klonerne blev derefter reduceret i størrelse, anbragt i en sekventeringsmaskine og samlet til strækninger, der repræsenterede humant DNA.
Andre DNA-sekventeringseksempler
Nye opdagelser inden for genomik ændrer dybtgående tilgange til sygdomsforebyggelse, påvisning og behandling. Regeringen har forpligtet milliarder af dollars til DNA-forskning. Retshåndhævelse er afhængig af DNA-analyse for at løse sager. DNA-testsæt kan købes til hjemmebrug til forskning i aner og identificere genvarianter, der kan udgøre sundhedsmæssige risici:
Etiske implikationer af DNA-sekventering
Nye teknologier har ofte muligheden for social gavn og skade; eksempler inkluderer funktionsdygtige atomkraftværker og masseødelæggelsesvåben. DNA-teknologier er også forbundet med risici.
Følelsesmæssige bekymringer omkring DNA-sekventering og genredigeringsværktøjer som CRISPR inkluderer frygt for, at teknologien kan lette kloning af mennesker, eller føre til mutante transgene dyr, der er skabt af en rogue forsker.
Oftere har etiske spørgsmål relateret til DNA-sekventering at gøre med informeret samtykke. Let adgang til DNA-test direkte til forbruger betyder, at forbrugere muligvis ikke helt forstår, hvordan deres genetiske information vil blive brugt, opbevaret og delt. Lækfolk er måske ikke følelsesmæssigt klar til at lære om deres mangelfulde genvarianter og sundhedsrisici.
Tredjeparter såsom arbejdsgivere og forsikringsselskaber kan potentielt diskriminere personer, der bærer mangelfulde gener, der kan give anledning til alvorlige medicinske problemer.