Indhold
- DNA-kloning: Definition og procesoversigt
- Plasmidvektormetoden
- PCR-metoden (polymerase-kædereaktion)
- Brug af plasmidvektor og PCR DNA-kloningsmetoder sammen
- Eksempler på DNA-kloning til bioteknologi
- Eksempler på DNA-kloning til forskning
- Eksempler på DNA-kloning til genterapi
Det er muligt at klone hele organismer såsom fåren Dolly, men DNA-kloning er anderledes. Det bruger molekylærbiologiteknikker til at fremstille identiske kopier af DNA-sekvenser eller enkeltgener.
Ved anvendelse af genteknologiske metoder identificeres og isoleres segmenter af den DNA-genetiske kode. DNA-kloning kopierer derefter nukleinsyresekvenserne i segmenterne.
De resulterende identiske kopier kan bruges til yderligere forskning eller til bioteknologiske applikationer. Ofte koder genet, der kopieres, for et protein, der kan indgå i medicinske behandlinger. DNA-teknologi inklusive DNA-kloning understøtter forståelsen af, hvordan gener fungerer, og hvordan den genetiske kode for mennesker påvirker kroppens funktion.
DNA-kloning: Definition og procesoversigt
DNA-kloning er molekylærbiologiprocessen til at fremstille identiske kopier af DNA-segmenter placeret i kromosomerne, der indeholder den genetiske kode for avancerede organismer.
Processen genererer store mængder af mål-DNA-sekvenser. Formålet med DNA-kloning er at fremstille mål-DNA-sekvenserne i sig selv eller at producere de proteiner, der er kodet i målsekvenserne.
De to metoder, der anvendes til DNA-kloning, kaldes plasmidvektor og polymerasekædereaktion (PCR). I plasmidvektor metode, DNA-strenge skæres ved hjælp af restriktionsenzymer til fremstilling af DNA-fragmenter, og de resulterende segmenter indsættes i kloningsvektorer kaldet plasmider til yderligere duplikation. Plasmiderne anbringes i bakterieceller, der derefter producerer DNA-kopier eller kodede proteiner.
I PCR-metode, er segmentet af DNA-strenge, der skal duplikeres, markeret med kaldte enzymer primere. Et polymeraseenzym fremstiller kopier af den markerede del af DNA-strengen. Denne metode bruger ikke restriktionsenzymer og kan producere klonet DNA fra små prøver. Undertiden bruges de to DNA-teknologimetoder sammen for at inkorporere de bedste egenskaber ved hver i en samlet reaktion.
Plasmidvektormetoden
Vektoren af fremgangsmåden henviser til det plasmid, der anvendes til at holde mål-DNA-segmentet, der skal klones. Plasmider er små cirkulære dele af ikke-kromosomalt DNA findes i mange organismer, herunder bakterier og vira.
Bakterielle plasmider er den anvendte vektor til indsættelse af mål-DNA-segmentet i bakterieceller til yderligere duplikation.
Valg og isolering af mål-DNA: Inden DNA-kloningsprocessen kan begynde, skal DNA-sekvenserne identificeres, især begyndelsen og enderne af DNA-segmenterne.
Sådanne DNA-sekvenser kan findes ved anvendelse af eksisterende klonet DNA med kendte sekvenser eller ved undersøgelse af proteinet produceret af måldNANA-sekvensen. Når først sekvensen er kendt, kan de tilsvarende restriktionsenzymer anvendes.
Skæring af mål-DNA med restriktionsenzymer: Restriktionsenzymer vælges for at lede efter DNA-koden i begyndelsen og slutningen af målsekvenserne.
Når restriktionsenzymerne finder en speciel kodet sekvens af basepar, der kaldes restriktionssteder, fastgør de sig til DNAet på det sted og vikler sig omkring DNA-molekylet, hvorved strengen adskilles. De udskårne DNA-segmenter, der indeholder målsekvensen, er nu tilgængelige til duplikering.
Valg af plasmidvektor og indsættelse af mål-DNA: Et egnet plasmid indeholder ideelt de samme DNA-kodende sekvenser som den DNA-streng, hvorfra mål-DNA'et blev skåret. Den cirkulære DNA-streng af plasmidet skæres med de samme restriktionsenzymer, som blev anvendt til at skære mål-DNA'et.
EN DNA-ligaseenzym anvendes til at fremme DNA-segmentbinding, og enderne af mål-DNA-segmentet forbindes med de afskårne ender af plasmid-DNA'et. Mål-DNA udgør nu en del af den cirkulære plasmid-DNA-streng.
Indsættelse af plasmidet i en bakteriecelle: Når plasmidet indeholder den DNA-sekvens, der skal klones, kan den faktiske kloning finde sted ved hjælp af en kaldet proces bakteriel transformation. Plasmiderne indsættes i en bakteriecelle, såsom E. coli, og cellerne med de nye DNA-segmenter vil begynde at producere kopier og de tilsvarende proteiner.
Ved bakterietransformation inkuberes værtscellerne og plasmiderne sammen ved kropstemperatur i ca. 12 timer. Cellerne absorberer nogle af plasmiderne og behandler dem som deres eget plasmid-DNA.
Høst af det klonede DNA og proteiner: De fleste plasmider, der anvendes til DNA-kloning, har antibiotikaresistensgener inkorporeret i deres DNA. Når bakteriecellerne absorberer de nye plasmider, bliver de resistente over for antibiotika.
Når kulturen behandles med antibiotika, overlever kun de celler, der har absorberet de nye plasmider. Resultatet er en ren kultur af bakterieceller med klonet DNA. Dette DNA kan derefter høstes, eller det tilsvarende protein kan produceres.
PCR-metoden (polymerase-kædereaktion)
PCR-metoden er enklere og kopierer eksisterende DNA på plads. Det kræver ikke skæring med restriktionsenzymer eller indsættelse af plasmid-DNA-sekvenser. Dette gør det især velegnet til kloning af DNA-prøver med et begrænset antal DNA-strenge. Mens metoden kan klone DNA, kan den ikke bruges til produktion af det tilsvarende protein.
Fjernelse af DNA-strengene: DNA i kromosomer er tæt opviklet i en dobbelt spiralstruktur. Opvarmning af DNA til 96 grader celsius i en kaldet proces denaturering gør DNA-molekylet opspolet og adskilles i to strenge. Denne adskillelse er påkrævet, fordi kun en enkelt streng DNA kan klones på én gang.
Valg af primere: Som med plasmidvektor-DNA-kloning skal DNA-sekvenserne, der skal klones, identificeres med særlig vægt på begyndelsen og enderne af DNA-segmenterne. Primere er enzymer, der binder sig til specifikke DNA-kodesekvenser, og de skal vælges for at markere mål-DNA-segmenterne. De rigtige primere vil fastgøre til DNA-molekylsekvenserne for at markere begyndelsen og enderne af målsegmenterne.
Udglødning af reaktionen for at binde primerne: Afkøling af reaktionen til ca. 55 grader Celsius kaldes annealing. Når reaktionen afkøles, aktiveres primerne og binder sig til DNA-strengen i hver ende af et mål-DNA-segment. Primerne fungerer kun som markører, og DNA-strengen behøver ikke at blive skåret.
Producerer identiske kopier af mål-DNA-segmentet: I en proces kaldet udvidelse, det varmefølsomme TAQ-polymeraseenzym sættes til reaktionen. Reaktionsblandingen opvarmes derefter til 72 grader Celsius ved aktivering af enzymet. Det aktive DNA-polymeraseenzym binder til primerne og kopierer DNA-sekvensen imellem dem. Den indledende DNA-sekventerings- og kloningsproces er afsluttet.
Forøgelse af udbyttet af klonet DNA: Den indledende annealings- og forlængelsesproces skaber relativt få kopier af de tilgængelige DNA-strengssegmenter. For at øge udbyttet gennem yderligere DNA-replikation afkøles reaktionen igen for at genaktivere primerne og lade dem binde til andre DNA-strenge.
Derefter aktiverer genopvarmning af reaktionen polymeraseenzymet igen, og der produceres flere kopier. Denne cyklus kan gentages 25 til 30 gange.
Brug af plasmidvektor og PCR DNA-kloningsmetoder sammen
Plasmidvektorfremgangsmåden er afhængig af en rigelig initial tilførsel af DNA til at skære og indsætte i plasmider. For lidt originalt DNA resulterer i færre plasmider og en langsom start på klonet DNA-produktion.
PCR-metoden kan producere en stor mængde DNA fra få originale DNA-strenge, men fordi DNA'et ikke er implanteret i en bakteriecelle, er proteinproduktion ikke mulig.
For at fremstille det protein, der er kodet i DNA-fragmenterne, der skal klones fra en lille initial DNA-prøve, kan de to metoder anvendes sammen, og de kan komplementerer hinanden. Først bruges PCR-metoden til at klone DNA fra en lille prøve og fremstille mange kopier.
Derefter anvendes PCR-produkterne med plasmidvektorfremgangsmåden til at implantere det producerede DNA i bakterieceller, der vil producere det ønskede protein.
Eksempler på DNA-kloning til bioteknologi
Molekylærbiologi bruger genkloning og DNA-replikation til medicinske og kommercielle formål. Bakterierne med klonede DNA-sekvenser bruges til at producere medicin og erstatte stoffer, som mennesker med genetiske lidelser ikke kan producere selv.
Typiske anvendelser inkluderer:
Bioteknologi bruger også genkloning i landbruget til at skabe nye egenskaber hos planter og dyr eller forbedre eksisterende egenskaber. Efterhånden som flere gener klones, stiger antallet af mulige anvendelser eksponentielt.
Eksempler på DNA-kloning til forskning
DNA-molekyler udgør en lille fraktion af materialet i en levende celle, og det er vanskeligt at isolere påvirkningerne fra de mange gener. DNA-kloningsmetoder leverer store mængder af en specifik DNA-sekvens til undersøgelse, og DNA'et producerer proteiner, ligesom det gjorde i den oprindelige celle. DNA-kloning gør det muligt at undersøge denne operation for forskellige gener isoleret.
Typiske applikationer inden for forskning og DNA-teknologi inkluderer undersøgelse af:
Når flere DNA-sekvenser klones, er det lettere at finde og klone yderligere sekvenser. De eksisterende klonede DNA-segmenter kan bruges til at bestemme, om et nyt segment matcher det gamle, og hvilke dele der er forskellige. Identificering af en mål-DNA-sekvens er derefter hurtigere og mere nøjagtig.
Eksempler på DNA-kloning til genterapi
I genterapi, et klonet gen præsenteres for cellerne i en organisme, hvis naturlige gen er beskadiget. Et vitalt gen, der producerer et protein, der kræves til en bestemt organismefunktion, kan muteres, ændres ved stråling eller påvirkes af vira.
Når genet ikke fungerer korrekt, mangler et vigtigt stof i cellen. Genterapi forsøger at erstatte genet med en klonet version, der producerer det krævede stof.
Genterapi er stadig eksperimentel, og få patienter er blevet helbredt ved hjælp af teknikken. Problemerne ligger i at identificere det enkelte gen, der er ansvarligt for en medicinsk tilstand og levere mange kopier af genet til de rigtige celler. Da DNA-kloning er blevet mere udbredt, er genterapi blevet anvendt i flere specifikke situationer.
De seneste vellykkede applikationer har inkluderet:
Genterapi er en af de mest lovende anvendelser af DNA-kloning, men andre nye anvendelser vil sandsynligvis spredes, når flere DNA-sekvenser undersøges, og deres funktion bestemmes. DNA-kloning leverer råmaterialet til genteknologi i de nødvendige mængder.
Når genernes rolle er kendt, og deres rigtige funktion kan sikres gennem udskiftning af mangelfulde gener, kan mange kroniske sygdomme og endda kræft angribes og behandles på genetisk niveau ved hjælp af DNA-teknologi.
Relateret indhold: