Ifølge University of Wisconsins BioWeb-webstedet er en PCR-primer et kort, syntetisk oligonukleotid (normalt mellem 18 og 25 baser lang), der bruges til at amplificere specifikke regioner af DNA i en molekylærbiologisk teknik kendt som polymerasekædereaktion (PCR). Både en fremadrettet og bagudgående primer er nødvendig, designet til at være omvendt komplement af DNA-strengen, for at flanke og binde til den ønskede DNA-region. Når forskere ønsker at udføre forskning på et specifikt DNA eller et specifikt DNA-område, skal de først udføre PCR for at erhverve nok af målregionen til at arbejde med. Designe primersekvenser for regionen af interesse kan være nødvendig, hvis de ikke allerede er tilgængelige gennem tidligere offentliggjort forskning eller med kommercielle midler.
Få nukleotidsekvensen af genet eller DNA-regionen af interesse, og beslutte, hvor længe et fragment du ønsker at forstærke. Den forreste og bagudgående primer er designet til at binde i begyndelsen og i slutningen af det ønskede fragment. Konventionelle PCR-metoder bruger typisk primere, der flankerer et område mellem 100 til 1.000 basepar lang, mens PCR-metoder i realtid bruger fragmenter, der er ca. 50 til 200 basepar lange.
Bestem, hvor i sekvensen du ønsker, at primerne skal ligge. F.eks. Ønsker du måske placeringen nær sekvensen 5 eller 3 enden eller i midten. Hvis det ønskes, skal du placere primerne til at spænde over en intron.
Følg de anbefalede retningslinjer for grundkonstruktion. Vellykket amplifikation af DNA-produkt afhænger af kvaliteten af primerne, og visse variabler er kritiske.
Design primere til at være 18 til 24 baser i længden. Vincent R. Prezioso, ph.d., fra Brinkmann Instruments Inc., antyder, at denne længde er lang nok til at være ekstremt specifik for den ønskede DNA-region, men kort nok til at binde (annealere) let. Primer-smeltetemperatur (Tm) skal være mellem 55 til 80 grader Celsius, lav nok til at muliggøre fuldstændig smeltning ved eller over 90 grader Celsius, men høj nok til at muliggøre udglødning. GC-indholdet (procentdel af Gs og Cs i sekvensen) skal være mellem 40 og 60 procent. 3-enden af primersekvensen bør ende i en C eller en G (kaldet en GC-klemme) for at fremme binding, da G- og C-nukleotiderne har stærkere bindinger, men undgå at have tre eller flere Gs eller Cs i de sidste fem baser af sekvensen.
Undgå at have kørsler med fire eller flere af en base (som ACCCC ...) eller fire eller flere di-nukleotid gentagelser (som ATATATAT ...), fordi de kan forårsage forkert priming.Design primere uden intra-primer-homologi (mere end tre baser, der supplerer i selve den ene primer) eller inter-primer-homologi (hvor den forreste og den bagerste primer har komplementerende sekvenser). Dette kan forårsage selvdimerer eller primer-dimerer, hvor primerne binder til sig selv i stedet for at binde til den ønskede DNA-sekvens.
Brug online ressourcer og websteder, der hjælper med design af primer eller hjælpe med at tjekke primersekvenser for selvkomplementaritet eller potentialet til at fremstille sekundære strukturer som hårnåle. Nogle primer-designwebsteder inkluderer Massachusetts Institute of Technologys Primer3, National Center for Biotechnology Information Primer-Blast og Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer.