Indhold
Når man arbejder med højtydende væskekromatografi (HPLC), er god kalibrering absolut vigtig for at sikre pålidelige kvalitetsresultater. Korrekt kalibrering af et HPLC-instrument begynder med udarbejdelsen af en passende kalibreringsstandard. I de fleste tilfælde kræver kalibrering faktisk en række standarder for stigende koncentration for at producere en såkaldt kalibreringskurve. Dette er en afbildet linje og tilknyttet ligning, der beskriver forholdet mellem koncentrationen af det kemikalie, der testes for, og reaktionen fra HPLC-detektoren.
Bestem det kemikalie, som du ønsker at teste til brug af HPLC ("analytten"). For eksempel kan du tænke dig at teste en serie læskedrikke med hensyn til fructoseindhold, i hvilket tilfælde fructose ville være analytten.
Få en mængde analytkemikalie med passende renhed. Normalt bør renheden være over 99%, og analytten skal købes fra et velrenommeret kemisk forsyningsfirma. I tilfælde af fruktose, for eksempel, vil du købe ren fruktose fra en kemisk leverandør og ikke fra en købmand.
Bestemm de maksimale og minimale forventede koncentrationer af analytten i de prøver, du har til hensigt at teste på HPLC. I tilfælde af læskedrikke skal du undersøge etiketterne på drikkevarer og bestemme det laveste og højeste fructoseindhold blandt de drikkevarer, du vil teste. Husk, at den indledende prøve (læskedrikken) kan fortyndes eller på anden måde manipuleres under forberedelse til analyse (afhængig af den anvendte HPLC-metode), og analytkoncentrationen i de prøver, der faktisk injiceres på HPLC, kan ændres. Det er analytkoncentrationen i prøverne, der køres på HPLC, der skal overvejes.
Bestem det opløsningsmiddel, hvor du vil opløse din analyt for at udgøre kalibreringsstandarder. Dette opløsningsmiddel skal være i stand til korrekt at opløse analytten over et relativt bredt koncentrationsområde (mindst lige så højt som i de prøver, du vil teste). Også dette opløsningsmiddel bør ideelt set være meget ligner den "mobile fase:" det opløsningsmiddel, der bruges til at transportere prøver gennem HPLC-instrumentet.
Beregn den mængde analyt, der kræves for at fremstille en "lagerstandard" -opløsning af analytten. Dette findes ved at multiplicere den krævede koncentration af stamstandarden med det ønskede volumen. Koncentrationen af analytten i denne opløsning skal være mindst 10% højere end den højst forventede prøvekoncentration. Hvis den højeste forventede fructosekoncentration i en sodavandprøve er 8 gram / 100 ml, kunne stamstandarden udføres til en koncentration på 10 gram fruktose / 100 ml. Et rimeligt volumen er 500 ml, således 8/100 ml x 500 ml = 40 gram fruktose ville være påkrævet.
Afvej den krævede mængde analyt til et passende præcisionsniveau. Ofte er en vægtværdi i gram nøjagtig til en eller to decimaler egnet, men mere præcision kan være nødvendig for nogle metoder.
Overfør den vejede analyt til en volumetrisk kolbe med det nødvendige volumen, og tilsæt det ønskede opløsningsmiddel til påfyldningsmærket på kolben. Brug af en volumetrisk kolbe (snarere end et gradueret bægerglas for eksempel) øger præcisionen for lagerstandardkoncentrationsværdien. Sørg for, at al analyt er overført til kolben. Brug om nødvendigt noget af opløsningsmidlet til at vaske det ind.
Stopp den volumetriske kolbe og ryst forsigtigt eller vend in, indtil analytten er helt opløst.
Lav en serie af forskellige fortyndinger af stamstandarden ved at overføre kendte volumener af stamstandarden til volumetriske kolber ved hjælp af pipetter til nøjagtig overførsel og derefter tilsætte opløsningsmiddel. Den laveste standardkoncentration skal være under den lavest forventede prøve, der skal analyseres. I sodavandsexemplet, hvis den lavest forventede fructosekoncentration i en prøve er 2 gram / 100 ml, kunne en standard på 1 gram / 100 ml fremstilles. Dette ville blive foretaget ved en ti gange fortynding af lagerstandarden. Standardserien skal omfatte i alt 5 eller 6 koncentrationer, så yderligere fortyndinger til frembringelse af standarder på måske 3, 5 og 8 gram fruktose / ml ville være påkrævet. Du har nu en række standardløsninger, som du kan kalibrere HPLC med.