Indhold
En celles genetiske blå kodes i dets genetiske materiale eller DNA. Da DNAet aldrig forlader cellekernen, er det nødvendigt først at transkribere DNA'et til messenger RNA (mRNA eller poly (A) RNA) for at denne information kan komme ind i cytoplasmaen, hvor andre proteiner og biokemiske komponenter findes. Dette mRNA oversættes derefter til proteiner, der udfører mange funktioner i cellen. For at detektere eller kvantificere meget sjældne mRNA'er, fremstille sonder til mikroarrays eller konstruere biblioteker med komplementære DNA-molekyler, skal mRNA isoleres. Imidlertid er total RNA (dvs. alt RNA i en celle) ekstraktion og efterfølgende mRNA-isolering ikke gensidigt eksklusive processer; førstnævnte skal udføres for at mRNA kan ekstraheres.
Isolering af mRNA fra total RNA
TRIzol-homogenisering: Total RNA inkluderer alt mRNA, transfer-RNA, ribosomalt RNA og andre ikke-kodende RNA'er. For at adskille disse fra andre cellulære komponenter sprænges cellen først for at frigive dens indhold. Dette gøres ved at resuspendere celler, der er pelleteret ved centrifugering (spinding i høje hastigheder) i TRIzol-reagens (Life Technologies). Andre versioner af TRIzol (såsom Ambions TRI-reagens) fungerer på samme måde.
Total RNA-isolering: En række centrifugeringer bruges til at adskille de forskellige komponenter (proteiner, DNA, RNA) af cellen i lag eller faser i suspensionen. Den øverste, gulfarvede fase består af fedt og kan kasseres. Den ønskede fase tones rød, indeholder det totale RNA og bevares. Efter at have udført en phenol-chloroform-ekstraktion og en række alkoholvask under anvendelse af isopropanol og ethanol, kan RNA pelleteres til mRNA-isolering. Tilføj RNase-hæmmere for at forhindre, at dette enzym nedbryder det totale RNA.
mRNA-ekstraktion: Det er almindeligt at bruge et kit til at isolere mRNA'er, da hjemmelavede laboratorieprotokoller ikke genererer store mængder stærkt oprenset mRNA'er. Kommercielle sæt inkluderer Invitrogen's FastTrack 2.0 eller Ambions Poly (A) Pure mRNA Isolation Kit. Disse grundlæggende trin er fælles for sådanne sæt:
a) Bland den RNase-inhiberede lysebuffer leveret i kittet med op til 300 mikroliter total RNA.
b) Opvarm i 5 minutter ved 65 grader og afkøles derefter straks prøven på is i et minut.
c) Bland dette med 0,5M natriumchlorid og opløs derefter Oligo dT (oligodeoxythymidylsyre) fuldstændigt i denne prøve.
d) Centrifuger denne prøve og udvind supernatanten, som vaskes flere gange i en række bindende og lavt saltbuffere tilvejebragt i sætene.
e) Eluer mRNA flere gange, indtil et kit-specificeret volumen (f.eks. 500 mikroliter) opnås.
f) Præcipiterer eluatet med natriumacetat og ethanoludfældning. Suspendér igen i op til 20 mikroliter diethylpyrocarbonat (DEPC) -behandlet vand.
g) Opbevares ved -80 grader celsius og kontroller for kvalitet og mængde ved hjælp af spektrofotometri.