Indhold
Polymerase-kædereaktion, eller PCR, er en teknik, der fotokopierer et fragment af DNA i mange fragmenter - eksponentielt mange. Det første trin i PCR er at opvarme DNA'et, så det denaturerer eller smelter i enkeltstrenge. Strukturen af DNA er som en rebstige, hvor rungene er reb med magnetiske ender. Magneterne forbinder sig og danner rungene, kaldet basepar, og modstår således at blive trukket fra hinanden. Hvert fragment af DNA smelter i enkeltstrenge ved forskellige temperaturer. At forstå, hvordan strukturen af DNA holdes sammen af DNA's individuelle dele, giver indblik i, hvorfor forskellige DNA-fragmenter smelter ved forskellige temperaturer, og hvorfor sådanne høje temperaturer er nødvendige i første omgang.
Melting! Melting!
Det første trin i PCR er at smelte DNA'et, så dobbeltstrenget DNA adskilles i enkeltstrenget DNA. For pattedyr-DNA involverer dette første trin normalt varme på ca. 95 grader Celcius (ca. 200 Fahrenheit). Ved denne temperatur binder brintet mellem A-T- og G-C-baseparene, eller skinner i DNA-stigen, og løsner det dobbeltstrengede DNA. Temperaturen er imidlertid ikke varm nok til at bryde fosfat-sukkerryggen, der danner de enkelte tråde, eller stigenes poler. Fuldstændig adskillelse af enkeltstrenge forbereder dem til det andet trin i PCR, der afkøles for at tillade korte DNA-fragmenter, kaldet primere, at binde de enkelte strenge.
Magnetiske lynlåse
En af grundene til, at DNA opvarmes til den høje temperatur på 95 grader Celcius, er, at jo længere den dobbelte DNA-streng er, jo mere ønsker den at blive sammen. DNA-længde er en faktor, der påvirker det smeltepunkt, der er valgt til PCR på det stykke DNA. A-T- og G-C-baseparrene i den dobbeltstrengede DNA-binding med hinanden for at holde dobbeltstrengestrukturen sammen. Jo mere sammenhængende basepar mellem to enkeltstrenge er bundet, jo mere vil deres naboer også binde, og jo stærkere bliver tiltrækningen mellem de to strenge. Det er som en lynlås lavet af små magneter. Når du lukker lynlåsen, vil magneterne naturligvis ønske at lynlåse og forblive lynlåse.
Stærkere magneter klæber sig mere tæt
En anden faktor, der påvirker, hvilken smeltetemperatur du skal vælge for dit DNA-fragment af interesse, er mængden af G-C-basepar, der er til stede i det fragment. Hvert basepar er som to minimagneter, der tiltrækker. Et par lavet af G og C er meget stærkere tiltrukket end et A- og T-par. Således kræver et stykke DNA, der har flere G-C-par end et andet fragment, en højere temperatur inden smeltning i enkeltstrenge. DNA absorberer naturligt ultraviolet lys - med en bølgelængde på 260 nanometer for at være præcist - og enkeltstrenget DNA absorberer mere lys end dobbeltstrenget DNA. Så at måle mængden af absorberet lys er en måde at måle, hvor meget dit dobbeltstrengede DNA har smeltet i enkeltstrenge. Den "magnetiske lynlås" -effekt af G-C- og A-T-basepar er det, der får en graf over lysabsorberingen af dobbeltstrenget DNA, der er afbildet mod en stigning i temperaturen, til at være sigmoid, formet som en S og ikke en lige linje. S-kurven repræsenterer teamwork-modstanden, som baseparene udøver mod varmen, fordi de ikke ønsker at adskille.
Halfway Point
Temperaturen, ved hvilken en længde af DNA smelter i enkeltstrenge kaldes dens smeltetemperatur, der betegnes med forkortelsen "Tm." Dette angiver temperaturen, ved hvilken halvdelen af DNA'et i en opløsning er smeltet til enkeltstrenge, og den anden halvdel er stadig i dobbeltstrenget form. Smeltetemperaturen er forskellig for hvert fragment af DNA. Pattedyr-DNA har et G-C-indhold på 40%, hvilket betyder, at de resterende 60% af baseparene er As og Ts. Dens 40% G-C-indhold får pattedyr-DNA til at smelte ved 87 grader Celcius (ca. 189 Fahrenheit). Dette er grunden til, at det første trin af PCR på pattedyrs DNA er at opvarme det til 94 grader Celcius (201 Fahrenheit). Bare syv grader varmere end smeltetemperaturen og alle dobbeltstrenge smelter fuldstændigt til enkeltstrenge.