Indhold
Ved kemiske reaktioner katalyseret af et enzym sænker enzymet den mængde aktiveringsenergi, der kræves ved midlertidigt at binde til underlaget og sno det til en anstrengt tilstand. K (katalysator) eller "kcat" til reaktionen henviser til den koncentrationsuafhængige konstant for den hastighed, med hvilken et bestemt enzym kan metabolisere et substrat i et produktmolekyle. For at beregne kcat blander forskere først flere reagensglas med forskellige koncentrationer af substrat (kendt som et "enzymatisk assay") og tester dem med konstante tidsintervaller med et lys spektrofotometer for at måle de voksende koncentrationer af produktmolekyler. Disse data plottes derefter på en graf og analyseres.
Beregning af starthastigheder
Planlæg et diagram over produktkoncentration versus tid for dataene fra det enzymatiske assays første reagensglas. Bemærk: den horisontale akse skal være "tid", og den lodrette akse skal være "produktkoncentration."
Beregn den lineære regressionslinje for de datapunkter, du planlagde i afsnit 1, trin 1. Mens Excel- og grafregnemaskiner let kan bestemme denne lineære model, kan du udlede et estimat af regressionslinjens hældning ved at dele forskellen i produktkoncentration mellem tilstødende data point efter deres tidsforskel.
Registrer hældningen for den lineære regressionslinie fra afsnit 1, trin 2, som "initial reaktionshastighed (Vo)." Bemærk: i regressionslinjemodellen "= m + b" er "koefficienten" m hældningen.
Gentag trin 1, 2 og 3 for resten af prøverørene i analysen.
Beregning af Vmax
Afbild det inverse af substratkoncentration for hvert reagensglas i forhold til det inverse af dets første reaktionshastighed (fra afsnit 1, trin 4). For eksempel, hvis den indledende hastighed for et reagensglas med en initial substratkoncentration på 50 mikromolar (uM) var 80 uM / s, ville inverserne være 1/50 uM for substratkoncentrationen og 1/80 uM / s for den indledende hastighed. Bemærk: Den inverse underlagskoncentration skal være på den vandrette akse, og den inverse initialhastighed skal være på den lodrette akse.
Bemærk: Underlagskoncentration skal være på den vandrette akse, og den indledende reaktionshastighed skal være på den lodrette akse.
Bestem den lineære regressionslinje for diagrammet, som du planlagde i afsnit 2, trin 1. Bemærk: fordi du bliver nødt til at kende y-skæringspunktet for regressionslinjen, skal du indtaste punkterne fra afsnit 2, trin 1 i enten Excel eller en grafer lommeregner og brug den indbyggede regressionsmodelleringsfunktionalitet.
Del 1 med y-skæringen fra den lineære regressionslinje. Dette giver dig værdien af det inverse af Vmax, den maksimale reaktionshastighed for enzymet. Bemærk: Hvis den lineære regressionsmodel har formen "= m + b," ville værdien af "b" være y-skæringen. Del 1 med "b" for at beregne det inverse af Vmax.
Del 1 med resultatet fra afsnit 2, trin 3 for at beregne den faktiske værdi af Vmax.
Bestemm enzymkoncentrationen i det originale assay (se de rå data). Bemærk: enzymkoncentrationen er den samme for alle prøverørene; kun substratkoncentrationerne varierer i analysen.
Del Vmax (fra Afsnit 2, Trin 4) med enzymkoncentrationen (fra Afsnit 2, Trin 5). Resultatet er værdien af Kcat.