Indhold
Et spektrofotometer bruges til at bestemme koncentrationen af visse forbindelser, såsom protein, i en opløsning. Generelt skinner et lys gennem en kuvette fyldt med en prøve. Mængden af lys, der absorberes af prøven, måles. Da forbindelser absorberer lys i forskellige spektrale intervaller, skal den rette bølgelængde indstilles til analysen. Der er adskillige måder at beregne koncentrationen af ukendte prøver ved hjælp af spektrofotometri, men anvendelse af referencestandarder giver den bedste nøjagtighed. Endvidere angiver standarder også, om spektrofotometret ikke fungerer eller andre problemer med analysen.
Beregning gennem ligelinier
Analyser referencestandarder i starten af analysen. Standarder er kendte koncentrationer og bruges til at kalibrere udstyr og kontrollere nøjagtigheden. Alle prøver bør falde inden for arbejdsområdet for standarderne. Hvis ikke, skal prøver fortyndes, eller koncentrationen af standarder øges.
Lav et spredningsdiagram eller en linjegraf med standardmålinger af koncentration og absorbans. Koncentrationen vil være på y-aksen, absorptionsevnen på x-aksen. For eksempel er standarderne 1 ppm, 2,5 ppm og 5 ppm. Den givne absorptionsevne var 1 ppm = 0,25, 2,5 ppm = 0,5 og 5 ppm = 0,75.
Formater trendlinjen for at få vist en ligning på grafen. Ligningen viser formlen y = mx + b. For eksempel ved anvendelse af standarderne i trin 2 er ligningen y = .1224x + 0.1531. De fleste trendlinjer opfanges ved nul, men det afhænger af analysemetoden og R-kvadratværdien.
Analyser ukendte prøver, og registrer absorbanslæsninger.
Brug ligningen (y = mx + b) til at bestemme koncentration af prøver.
Forstå lige linje ligning
Lad "Y" svare til koncentrationen. Dette er, hvad der vil blive løst for.
Lad "X" svare til prøvens absorptionsevne. Dette er absorptionsevnen målt ved spektrofotometer.
Lad “” svare til hældningen og “b” for at være lig med y-skæringen. Begge er givet, men hvis trendlinjen blev tvunget igennem 0, vil “b” være 0.
Opløs til koncentrering. Ved at bruge eksemplet i trin 3, erstattes "x" som en given absorptionsevne på .563. Derfor:
y = .1224 (.563) + 0,1531
y (koncentration) = .222011