Indhold
Gelelektroforese er en teknik, der gør det muligt at analysere DNA på niveau med dets bestanddele molekyler. I denne DNA-visualiseringsmetode anbringes prøver på et agarosegelemedium, og et elektrisk felt påføres gelen. Dette får fragmenter af DNA til at migrere gennem gelen i forskellige hastigheder i overensstemmelse med deres elektrokemiske egenskaber.
Ethidium bromid
Til denne visualiseringsteknik blandes ethidiumbromid med agarosepulver, EDTA-puffer og vand til dannelse af gelmatrixen inden elektroforese. Som et resultat bliver ethidiumbromidmolekylerne ensartet spredt over matrixen. Når gelbrønde er blevet fyldt med deres respektive DNA-prøver og sporing af farvestoffer, påføres spænding for langsomt at trække de store, polære forbindelser hen over matrixen.
Under denne bevægelse binder DNA-molekylernes baser midlertidigt til partiklerne takket være ethidiumbromidladningen og trækker dem med. Når gelelektroforese er afsluttet, er hvert DNA-molekyle opsamlet i en betydelig mængde ethidiumbromid.
I nærvær af ultraviolet lys udviser ethidiumbromid fluorescens. Teknikere skinner et specielt kalibreret UV-lys over gelen, mens en maskine fanger billedet af de glødende fragmenter.
Methylen Blue
Hvis en UV-transilluminator ikke er tilgængelig eller praktisk, kan teknikere gøre DNA synligt under normal tilstand ved at blødgøre den færdige agarosegel med elektroforeret DNA inde i en opløsning af methylenblåt natten over.
Et chloridsalt med en markant hydrofob anion, methylenblå molekyler trænger igennem hele gelmatrixen. Imidlertid får hydrogenbinding i hele DNA farvemolekylerne til at akkumuleres. Denne øgede DNA-pletdensitet giver en dybere skygge af blå, synlig for det blotte øje.
Sporing af farvestoffer
Ud over den relative størrelse af DNA-båndene, kan teknikere måle den absolutte størrelse (i basepar) af hvert fragment ved hjælp af kemikalier, der kaldes sporingsfarvestoffer. Synlig uden tilsætning af methylenblåt eller ethidiumbromid bevæger sporingsfarvestoffer såsom bromophenolblåt og xylencyanol sig hen over aragosegel-matrixerne under elektroforese med samme hastighed som DNA-fragmenter bestående af henholdsvis 300 nukleotider og 4.000 nukleotider. Ved elektroforese bevæger mere massive DNA-fragmenter sig over gelmatrixen med en langsommere hastighed end mindre fragmenter. Selvom sporing af farvestoffer ikke direkte påvirker synligheden af DNA-fragmenter, gør sammenligningen af et DNA-fragment i gelen med placeringen af disse farvestoffer det muligt for teknikere at "se" det omtrentlige antal nukleotider, som DNA-fragmentet indeholder.