Indhold
Gram-pletten er en differentieret farvningsprocedure, der viser, hvilke bakterier der er Gram-positive eller Gram-negative, baseret på deres farve. Acetonalkohol er et reagens, der bruges i denne proces til at tilvejebringe farvedifferentiering. Gram-positive bakterier har et tykt peptidoglycan-lag og pletter purpur, mens gram-negative mikroorganismer har lidt eller intet peptidoglycan-lag og pletrosa.
Primær Stain-Crystal Violet
Når der først er fremstillet et objektglas af bakterieprøve, anvendes krystalviolet til først at plette prøven. På dette tidspunkt vises både gram-positive og gram-negative bakterier lilla. Normalt påføres krystalviolet på objektglaset i 30 sekunder, før der overskylles overskydende pletter med vand. Krystallviolet kan klæbe lidt til de peptidoglykanske lag, så ikke alle de primære pletter vaskes med vandet.
Mordant-Jod
Jod sættes derefter til prøven i et minut. Det fungerer som en mordant, der tjener til at fikse farvestoffer i en farvningsproces. Jod udfører denne funktion ved at binde til det krystalviolette og skabe et uopløseligt kompleks, der klæber meget bedre til det tykke peptidoglykanlag, der findes i gram-positive bakterieceller end kun den krystalviolette alene. Der er ikke et vasketrin med vand efter tilsætning af jod.
Affarvningsmidlet-Alkohol
Enten acetone eller ethylalkohol kan anvendes som affarvningsmiddel. Alkoholen opløser lipider, der findes i den ydre cellemembran af gramnegative bakterier, hvilket tillader, at krystalviolet-jodkomplekset lækker ud af det tyndere peptidoglycan-lag. Alkoholen tilsættes i 10 til 20 sekunder; det hældes på objektglaset, indtil al jod vaskes væk, og afstrømningen er farveløs. På dette tidspunkt i Gram-farvningsprocessen er Gram-negative bakterier farveløse, mens Gram-positive bakterier stadig beholder krystalviolet. Når objektglasset er færdig, skal det skylles med vand for at stoppe affarvningseffekten.
Kontrafarve-Safranin
Safranin tilsættes derefter for at øge synligheden og kontrasten til de farveløse Gram-negative bakterier. Pletten får disse bakterier til at virke lyserøde under mikroskopet. Da pletten føjes til hele prøven, pletter den også grampositive bakterier, men den mørkere af krystalviolet skjuler den lysere safraninrosa farve. Når objektglasseprøven er blevet oversvømmet med safranin i cirka et minut, anvendes vand til at vaske eventuel overskydende plet, der ikke klæber til bakteriecellerne.